摘要：目的建立基于谱效关系的藏药材全缘叶绿绒蒿Meconopsisintegrifolia全草（非花入药部位）（HMI）的质量标志物研究方法，为其质量控制提供依据。方法测定10批次HMI提取物的UPLC指纹图谱、UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法对化学成分进行指认，测定10批样品的总抗氧化能力、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基抑制能力，采用主成分分析法筛选能更大程度反映HMI提取物的抗氧化能力指标，采用灰色关联度法关联抗氧化能力指标与指纹图谱共有峰的相关性，综合分析筛选质量标志物，HSCCC法分离鉴定所筛选化学成分的结构。结果从HMI提取物指纹图谱确定了29个共有峰，UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法指认了样品中的18种化学成分，包括16种*酮类成分和2种生物碱类成分；主成分分析法筛选出DPPH清除能力能更大程度反映HMI提取物的抗氧化能力；灰色关联度分析表明29个共有峰与DPPH清除能力的关联度均大于0.5，综合分析确认槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-[2′′′-O-乙酰基-β-D-半乳糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]作为HMI的质量标志物，其中槲皮素-3-O-[2′′′-O-乙酰基-β-D-半乳糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]为新化合物。结论基于谱效关系的HMI质量标志物的研究，对阐明药效物质基础、筛选与药效相关的核心质量标志物，保证药材质量的可控性和合理应用有重要意义。
传统药物的质量控制是传统药物现代化发展的关键问题之一[1]，但由于传统药物化学成分的多样性、复杂性和质量的不稳定性等因素，使得质量控制研究一直是研究者面对的难点问题。中药质量标志物（Q-marker）概念和理论的提出[2]，为传统药物科学、合理的质量控制提供了理论依据和研究方向。全缘叶绿绒蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim.)Franch为传统藏药材，具有悠久的使用历史和广泛的应用，《晶珠本草》记载其为“欧贝”类绿绒蒿的来源之一，分花和全草入药，具有“清肝热、肺热”作用[3-4]。研究表明，绿绒蒿属药用植物的主要化学成分为生物碱和*酮类成分[5-6]，其中绿绒蒿总*酮具有很好的肝损伤保护、抗炎等作用，而生物碱具有很好的镇痛、抗炎作用[7-8]。由于花的产量非常低，藏医临床和藏成药多用于重症或者急症；藏医临床和藏成药常用产量较高的全缘叶绿绒蒿全草（非花入药部位）（HMI）入药，但是其哪些成分起主要药效仍未得到阐明。更为重要的是，HMI的质量控制中尚未找到指标性成分。因此，为了藏医临床和藏成药中能够有效、可控、安全使用产量较高的HMI，需阐明其药效物质和筛选与其药效密切相关的质量评价标志物。
研究表明，活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）引发的氧化应激是多种肝病的共同病理生理基础[9]。病肝组织中过剩的ROS可能来源于肝细胞线粒体呼吸链复合体利用电子传递生成ATP、细胞色素PE1和过氧化物酶体的诱导引起代偿性脂肪酸氧化，过剩的铁和过氧化氢反应生成OH?也可能是肝病氧化应激的原因之一，过量的ROS通过多种途径与细胞因子共同作用引起不同程度的肝损伤[10]。因此，推测HMI的抗氧化活性与其肝损伤保护作用具有密切关系。
本研究采用谱效关系的研究方法，通过建立HMI提取物指纹图谱并确定共有峰，UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法分析HMI提取物的化学成分组成，将指纹图谱的共有峰与抗氧化结果进行主成分分析和灰色关联度分析，建立谱-效模型，筛选HMI中具有抗氧化活性的成分，进而采用高速逆流色谱（HSCCC）法分离可作为质量标志物的成分，鉴定化合物结构，为研究HMI药材的药效物质基础、质控指标的筛选提供科学依据。
1材料与仪器
1.1仪器
WatersQuattroPremierXE液质联用仪，美国Waters公司；WatersAcquity超高效液相色谱仪，美国Waters公司；TU-紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；高速逆流色谱仪，包括AKTA-Prime溶剂泵系统，美国GE公司，TBE-B半制备型高速逆流色谱主机，上海同田生化技术有限公司；IKARV10旋转蒸发仪，德国IKA公司；TelstarLyoQuest冷冻干燥机，西班牙Telstar公司；SartoriousBT25S十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。
1.2材料与试剂
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷（自制，质量分数为98%）；异槲皮苷（批号MUST-），质量分数99%，成都曼斯特生物科技有限公司；槲皮素（批号-），质量分数96%，中国食品药品检定研究院；芦丁（批号-），质量分数为92%，中国食品药品检定研究院；没食子酸（批号MUST-），质量分数为98%，成都曼斯特生物科技有限公司；DPPH，悌希爱（上海）化成工业发展有限公司；福林-酚试剂（1N），北京Solarbio科技有限公司；抗坏血酸（VC），广东光华科技股份有限公司；2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），成都市科龙化工试剂厂；2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5三嗪（TPTZ），北京百灵威科技有限公司；ABTS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗超氧阴离子试剂盒，南京建成生物工程研究所；HPLC级乙腈，Sigma公司；HPLC级冰醋酸，天津科密欧化学试剂有限公司；D-葡萄糖（批号）、D-半乳糖（批号）、D-甘露糖（批号），质量分数均大于98%，成都格利普生物科技有限公司；碳酸钠、氯化铝、过硫酸钾、硫酸亚铁、氯化铁、盐酸、氢氧化钠、醋酸钠、醋酸乙酯、正丁醇为国产分析纯；水为蒸馏水，屈臣氏公司。
HMI提取物为自制，采用课题组前期优化的大孔树脂富集纯化绿绒蒿总*酮的方法制备提取物，全缘叶绿绒蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim.)Franch全草（非花入药部位）样品均采自四川省，经西南民族大学刘圆教授鉴定，具体信息见表1。
2方法
2.1供试品溶液的制备
取药材粉末约20g，加8倍体积的70%乙醇，热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，45℃减压回收溶剂，残渣用适量蒸馏水溶出，冷冻干燥成浸膏干粉，保存于4℃冰箱中备用。
2.1.1抗氧化试验供试品溶液精密称取50mg浸膏干粉，50%乙醇溶解，定容至50mL量瓶，得质量浓度1.0mg/mL的供试品溶液，保存于4℃冰箱中备用。
2.1.2指纹图谱供试品溶液精密称取25mg浸膏干粉，50%甲醇溶解，定容至25mL量瓶，制成质量浓度1.0mg/mL供试品溶液，保存于4℃冰箱中备用。
2.2对照品溶液的制备
精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、异槲皮苷适量，加甲醇溶解，得含槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、异槲皮苷质量浓度分别为0.2、0.1、0.2mg/mL对照品溶液。
2.3UPLC指纹图谱的建立
2.3.1色谱条件和质谱条件色谱柱：AcquityUPLCHSST3色谱柱（mm×2.1mm，1.8μm），流动相为乙腈（A）-0.1%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱：0～10min，4%～14%A；10～20min，14%～16%A；20～30min，16%～25%A；30～35min，25%～60%A；体积流量0.3mL/min，柱温30℃，检测波长～nm，进样量2μL。
离子源为ESI源，正离子检测模式，质量扫描范围m/z～0，离子源温度℃，毛细管电压2.8kV，脱溶剂温度℃，脱溶剂气体流速L/h，锥孔电压25kV，锥孔气流量40L/h。
质谱数据采用MarkerLynx4.0软件分析。
2.3.2指纹图谱测定将10批HMI提取物按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项中的色谱条件进行色谱分析，建立UPLC指纹图谱。
2.4酚类化合物的含量测定
2.4.1总*酮含量测定总*酮的测定参考郑媛媛等[11]的方法。在10mL离心管中加入0.15mL供试品溶液（其中样品S4和S5因含量较低，取样量为0.30mL），加入2.5mL质量分数为1%AlCl3溶液，加入适量70%乙醇使反应体系体积为5.0mL，室温反应1h，反应结束后于nm处测定吸光度（A）值。配制质量浓度为0.2mg/mL的芦丁母液，取、、、、、μL芦丁母液，按照上述方法测定A值，绘制标准曲线。总*酮含量以芦丁计，以每克浸膏干粉中芦丁的含量表示。
2.4.2总多酚测定总多酚的测定参考房祥军等[12]建立的方法，采用Folin-Ciocalteu法测定。在10mL离心管中加入0.15mL供试品溶液（其中样品S4和S5因含量较低，取样量为0.30mL），加入1.5mL福林-酚溶液和2.0mL10%Na2CO3溶液，补充蒸馏水使反应体系体积为5.0mL，室温避光反应1h，反应结束后于nm处测定A值。配制质量浓度为0.mg/mL的没食子酸母液，取、、、、、、μL没食子酸母液，按照上述方法测定A值，绘制标准曲线。总多酚含量以没食子酸计，以每克浸膏干粉中没食子酸的含量表示。
2.5体外抗氧化能力测定
2.5.1总抗氧化能力测定总抗氧化能力测定参考Benzie等[13]建立的FRAP法。TPTZ工作液由10mmol/LTPTZ、20mmol/LFeCl3和pH3.6醋酸盐缓冲液溶液按10∶1∶1组成，现用现配。取1.5mL供试品溶液和1.5mLTPTZ工作液于比色管中，混合均匀后于37℃水浴反应20min，测定nm处A值。配制质量浓度为2.78mg/mL的FeSO4母液，依次稀释成27.、13.、6.、3.、1.μg/mL的对照品稀释液，按照上述方法测定A值，绘制标准曲线。以Fe3+-TPTZ被还原成Fe2+-TPTZ形式的蓝色物质的生成量表示总抗氧化能力。
2.5.2ABTS自由基清除能力参考Zhou等[14]建立的方法。ABTS工作液配制：由等体积7mmol/L的ABTS水溶液和2.45mmol/L过硫酸钾水溶液混合后，室温避光反映16h，以80%乙醇稀释，当nm处A值为0.±0.时，得ABTS工作液。将供试品溶液稀释成3.、6.25、12.50、25.00、50.00、.00、.00μg/mL的溶液，取0.4mL各浓度样品溶液和2.6mLABTS工作液，37℃避光反应30min，测定nm处A值。以70%乙醇作为空白溶液代替样品作为空白，同时以70%乙醇作为空白对照，以Vc和BHT为阳性对照，清除率按下式计算：
As为空白溶液，即70%乙醇加DPPH的A值；Ai为样品溶液和DPPH反应后的A值；A0为空白对照的A值
2.5.3DPPH自由基清除能力参考Zhou等[14]建立的方法。供试品溶液稀释浓度同“2.5.2”项下的稀释方法，取0.4mL各质量浓度样品溶液和2.6mL0.mmol/LDPPH无水乙醇溶液，37℃避光反应1h，测定nm处A值。以70%乙醇作为空白溶液，以无水乙醇作为空白对照，以VC和BHT为阳性对照，清除率按“2.5.2”项下的公示计算。
2.5.4抑制超氧阴离子自由基能力按“抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基试剂盒”说明书操作步骤进行试验。
2.6HSCCC分离条件
采用课题组前期建立的分离全缘叶绿绒蒿花化学成分的方法[15]。以醋酸乙酯-正丁醇-水（2∶3∶5）为溶剂体系，按比例混匀后以上相作为固定相，下相作为流动相，将HMI提取物适量溶于20mL下相中，备用。高速逆流色谱仪转速r/min，体积流量2.0mL/min，紫外检测器波长nm，循环水浴温度35℃，固定相保留率为46%。
3结果与分析
3.1HMI的指纹图谱
3.1.1方法学考察对实验方法进行精密度、稳定性、重复性考察，结果测试样品色谱图相似度RSD均小于3%，符合分析要求。
3.1.2UPLC指纹图谱10批HMI提取物样品按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统4A版”软件，对指纹图谱进行处理，结果见图1。以HMI提取物指纹图谱的共有模式作为匹配依据，进行相似度评价，结果见表2。
确定了29个共有峰，共有峰与对照指纹图谱的相关系数均大于0.90，表明共有峰具有代表性，能够标示成分特征。通过与对照品比对，23号峰为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷，29号峰为槲皮素。
3.2UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法鉴别HMI提取物中的主要成分
对采集于康定县折多山二台子的S9号样品进行UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析，正离子模式基峰色谱图见图2。结合对照品保留时间、对照品质谱裂解规律、文献数据比对等方法指认化学成分，从样品质谱数据中共指认18种化学成分，包括16种*酮类成分和2种生物碱类成分，结果见表3。
通过对照品对照，确定保留时间（RT）13.6min的峰（M2）为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷，RT为31.3min的峰为槲皮素（M18），RT为18.4min的峰（M8）通过提取离子的方式，与异槲皮苷对照品保留时间比对，确认为异槲皮苷。此外，通过与课题组前期已确认主要成分的全缘叶绿绒蒿花的提取物在相同色谱条件下分析，结合质谱数据，确认RT为15.1min的峰（M3）为槲皮素-3-O-[2′′′-O-乙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]，RT为16.1min的峰（M5）为槲皮素-3-O-[3′′′-O-乙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]，RT为16.5min的峰（M6）为槲皮素-3-O-[6′′′-O-乙酰基-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷]。其他所指认的*酮类成分通过与槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-β-D-葡萄糖苷的质谱数据对比和推测确认。
生物碱类成分的指认通过RT为19.0min的白屈菜碱（M9）的解析进行说明。正离子模式一级质谱中，可见其准分子离子峰m/z.13[M＋H]+，预测分子式为C20H19NO5。二级质谱中，m/z.13丢失1分子H2O，产生m/z.12[M＋H－H2O]+，m/z.13也能丢失1分子H2O和H2产生m/z.09[M＋H－H2O－H2]+。m/z.12失去C2H5N，生成m/z.09[M＋H－C2H5N]+。m/z.09失去CH3N，生成m/z.08[M＋H－CH3N]+。此外，m/z.13可发生开环，生成m/z.09，结合文献[6]和研究数据[16]，推测该成分为白屈菜碱。白屈菜碱正离子模式可能的质谱裂解途径见图3。
3.3体外抗氧化活性研究
10批HMI提取物总*酮、总多酚含量以及体外抗氧化试验结果见表4。不同批次的HMI提取物中有较高含量的*酮类和多酚类化合物，都具有很强的体外抗氧化活性，但提取物中各化合物的含量高低、成分差异与抗氧化活性有何关联，以谱效关系进行研究。
3.4谱效学研究与活性物质筛选
3.4.1主成分分析（principal
