治白癫疯办法 http://m.39.net/pf/a_6113618.html研究背景：博落回是罂粟科博落回属多年生草本植物，富含血根碱（Sanguinarine，SAN）、白屈菜红碱（Chelerythrine，CHE）、原阿片碱（protopine，PRO）和别隐品碱（Allocryptopine，ALL），但博落回不含具有成瘾性的化合物。SAN和CHE具有抗菌和促进动物生长的作用。博落回是野生品种，尚未广泛栽培。在本研究中，作者对博落回进行了二代基因组测序，基因组大小为.5Mb，杂合度0.92%，重复序列63.06%，属于二倍体普通基因组。基因组组装到Scaffold水平。作者结合同位素示踪、代谢物谱分析、基因表达分析、体外酶促反应等方法对博落回中SAN和CHE的代谢途径进行了分析，初步阐述了相关化合物的生物合成途径。
研究结果：
为了检查SAN和CHE生物合成途径是否在博落回中保守，作者首先用LC/MS检测了博落回中的所有中间体。在植物培养基中添加了13C6标记的酪氨酸，图1中的中间体除6-hydroxyprotopine（Cp16）和6-hydroxyallocryptopine（Cp23）外都检测到了。这一结果表明SAN和CHE的生物合成途径在罂粟科是保守的。意外的是，N-methylscoulerine(Cp26)andN-methylcheilanthifoline(Cp27)这两个在酵母中异源生产的副产物第一次在植物中检测到了。表明代谢途径是网格化的，而不是线性的。
接着，作者检测了化合物在各组织部位中含量的差异。在别的罂粟科植物中，根是产生SAN和CHE的主要部位，但是在博落回中则主要在蒴果（capsule）中积累，这表明可能存在蒴果特异性酶或潜在的转运体。但是，PRO（Cp15)和ALL（Cp22)这两个化合物在根中积累最高，在叶、花和蒴果中适中，在茎中微量。别的中间体积累模式相似，积累量显著低于PRO和ALL。
博落回是二倍体，染色体数目为10对。利用HiSeq，测序文库的插入片段大小为bp-10kb，bp长度的paired-end测序产生了.5Gb的数据。19-Kmer分析产生的序列表明基因组大小为.5Mb，杂合度为0.92%，属于普通二倍体基因组。最终组装出来的基因组有个scaffolds组成，跨越Mb，scaffold和contigN50分别为kb和25kb。组装出来的scaffold有条在51.9kb以上，占整个基因组的90%，占整个注释基因的95.4%。.5Mb中的30%在最终组装出来的基因组中缺席，这是因为基因组中有高达63.1%的重复序列。基因组包含来自NCBI的个博落回EST中的95%。利用Trinity预测全长转录本，全长转录本来自于22个博落回样本。基于BLAST，预测出个编码基因，其中89%（/）存在与全长转录本有重叠的部分。基于BUSCO，鉴定出91.3%的完整真核生物保守基因（/）和90.4%的完整植物保守基因（/），这表明在组装出来的基因组具有高覆盖率。
基于三种基因预测的方法(cDNA-EST,ahomology-basedmethod,andabinitio)，作者预测了个蛋白编码基因，基因、外显子、内含子的平均长度为bp、bp、bp。大约94.03%的基因在TrEMBL蛋白数据库中有同源基因，78.61%的基因可以被InterPro分类。基于转录组数据发现超过88%的基因在根、叶、或果实中表达。这些结果表明对基因组中基因功能预测的精确性较高。另外，从基因组中鉴定出个非编码RNA，包括个rRNA，个tRNA和75个小RNA以及个小核RNA。基于序列相似性，博落回的蛋白编码基因和11个其他已测序被子植物被用于鉴定同源基因簇。使用无油樟作为外类群，一共有个冗余基因被划分为个直系同源基因簇，每个基因簇至少包含2个基因。个博落回基因由个家族组成。其中个是博落回特有基因家族，共包括个基因。基因家族大小的变异是形成不同物种自然适应变异的重要机制。不同基因家族间的平均扩张和收缩是不同的（Fig.17）。97个基因家族中，有个进化是非随机的（P0.01）。其中个基因家族包含博落回基因。在个快速进化的基因家族中，有31个在博落回分支发生了显著变化（P0.01）。其中，28个基因家族显著扩张，包括个基因。例如，DBOX，这个家族在博落回基因组中显著扩张（35个DBOX），而在莲花中有9个，洛杉矶耧斗菜中有4个，葡萄中1个，拟南芥中有10个，水稻中有5个。
在博落回的基因组中，没有发现古六倍化事件。这与莲相似。再结合上次文献中说罂粟也不存在古六倍化事件，表明这一类的植物应该都没有经历古六倍化事件。葡萄和博落回的syntenicblocks分析发现，葡萄的一个区域通常对应博落回的2个区域，博落回的一个区域通常对应葡萄的三个区域，这表明博落回可能存在特异的基因组加倍事件。在博落回中有个基因来自此次加倍事件，其中（55.7%）是单拷贝，个（26.5%）是重复的，个（17.8%）基因包含3个以上的同源基因。旁系同源基因的Ks和four-folddegeneratesitetransversion（四倍简并位点替换率，4DTV。见“阅读全文”）分析也支持这一特异的基因组加倍事件。
基于葡萄和博落回基因组之间的Ks分析结果，博落回的thelineagenucleotiderate比葡萄的更低，葡萄-博落回的分化时间应该比古六倍化事件更早。博落回和莲之间的4DTV和Ks分布更加相似，这也表明博落回特异的基因组加倍事件大约发生在98±16百万年前。
通过对基因组进行序列相似性搜索，共鉴定出39个SAN和CHE途径中的候选基因，并利用RNA-seq数据进一步缩小候选基因范围。由于SAN和CHE不在茎中积累，所以首先排除了在茎中高表达的基因，这将候选基因减为16个。进一步利用qPCR对这些基因进行表达量分析。将这些基因在酿酒酵母中表达，并加入底物在验证功能。最终验证了SAN和CHE途径中除SPS和MSH外的所有涉及的酶。McSPS和McMSH验证失败，但最可能的原因是它们在酵母中表达量较低，因为在罂粟中这两个酶也有类似问题。博落回中没有STORR的同源基因，这与其不含吗啡可待因等上瘾性化合物相一致。除McP6H外，这些酶大多数与来自其他植物的同源没相比具有相似的催化能力，McP6H可能比花菱草的催化能力更强。
除了寻找同源酶，作者还利用同位素示踪的方法来揭示完整的生物合成途径。之前认为只有酵母中才有的Cp27，这次在博落回中发现了，表明可能存在下图中橙色箭头的所示的网格途径，但是目前还没有发现相关的P可以催化Cp26和Cp27产生Cp14。如果这样的旁路被证实，就可以抵消由TNMT带来的副产物问题。本实验也首次证实了norlaudanosoline(Cp30),6-O-methylnorlaudanosoline(Cp31),andnorreticuline(Cp32)在植物中的存在。Mc6OMT也能对未加羟基的两个底物（Cp30和Cp31）进行甲基化。而McCNMT可以对Cp31和Cp32进行N甲基化，所以在博落回中可能存在一个环形通路。
SAN和CHE主要在capsule中积累，而大多数中间体在除茎以外的整个植物中合成。与这一结果一致的是，两个McDBOXs仅在capsule中特异性表达。而McP6H在根中高表达，并且它们的底物在根中也都大量存在，但它们的催化产物并没有在相同的部位积累，这表明可能存在一种转运方式，将根中产物转运到capsule中。该转运机制需要进一步研究。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
